BIOSENSOR BI-ENZIMATIK

PENGGUNAAN BIOSENSOR BI-ENZYMATIC WHOLE CELL UNTUK DETEKSI ION LOGAM DAN PESTISIDA PADA SAMPEL AIR

Oleh:

Afifa Husna                125100100111015

Nur Khasanah N         125100107111054

Kelas Q

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2015

PENDAHULUAN

Air merupakan elemen terpenting bagi kehidupan karena selain untuk dikonsumsi langsung, air juga digunakan di berbagai keperluan manusia salah satunya pengairan pertanian. Namun, saat ini penggunaan berbagai zat berbahaya seperti pestisida dan bahan yang mengandung logam berat oleh manusia membuat banyak sumber air bersih tercemari. Sehingga perlu kehati-hatian dalam memilih sumber air yang akan digunakan untuk berbagai kebutuhan. Karena air dalam penggunaanya sangat luas dan kontinyu, maka dibutuhkan pengujian yang efisien untuk pengujiannya (Chouteau et al., 2005).

Pemakaian pestisida didominasi oleh dua jenis insektisida yaitu senyawa karbamat dan organofosfat yang banyak digunakan pada bidang pertanian. Hal ini dikarenakan kestabilannya yang rendah di lingkungan dibandingkan jenis organoklorin. Keduanya merupakan senyawa yang membahayakan karena merupakan penghambat kerja kelompok enzim hidrolase (esterase) yang terdapat pada saraf pusat manusia yaitu enzim asetilkolinesterase (AChE). Enzim ini berfungsi untuk menghidrolisis asetikolin pada membran untuk mencegah terjadinya akumulasi. Penghambatan AChE ini membuat asetilkolin terakumulasi sehingga terjadi disfungsi beberapa sistem saraf dan memicu kerusakan sistem pernafasan yang dapat menimbulkan kematian (Mashuni dkk., 2010).

Sedangkan residu logam berat semakin meningkat seiring dengan meningkatnya aktivitas industri dan domestik. Jika sampai cemaran logam berat ini mengenai perairan yang digunakan untuk irigasi lahan pertanian, maka akan sangat membahayakan. Sifat logam berat yang akumulatif memungkinkannya untuk terakumulasi dalam hasil pertanian (Arifin dkk., 2005). Sudah sejak lama diketahui logam berat merupakan salah satu penyebab terjadinya berbagai gangguan kesehatan bahkan penyebab kematian jika terus terakumulasi dalam tubuh.

Oleh karenanya dibutuhkan metode pengujian yang cepat dan praktis dalam mengidentifikasi adanya kedua jenis residu senyawa polutan tersebut. Jika pengujian dilakukan satu per satu akan membutuhkan waktu yang lama padahal kebutuhan manusia akan air tersebut harus segera dipenuhi. Karena sudah ada penelitian mengenai penggunaan biosensor yang mengidentifikasi kedua senyawa tersebut secara terpisah, maka penelitian ini dimaksudkan untuk membuat perangkat alat biosensor yang mempunyai berbagai kelebihan dibandingkan sebelumnya.

Jika selama ini perangkat biosensor hanya menggunakan satu jenis enzim murni yang hanya peka terhadap salah satu senyawa toksik, maka perangkat biosensor yang akan dibuat kali ini adalah biosensor dengan menggunakan dua enzim sehingga mempunyai sensitivitas terhadap lebih dari satu senyawa. Enzim ini didapatkan dari salah satu organisme yang mempunyai enzim tersebut secara sekaligus yaitu mikroalga Chrorella vulgaris yang dapat mendeteksi keberadaan residu ion logam berat dan pestisida. Penggunaan organisme hidup ini juga akan membuat biaya lebih murah karena bisa dikembangbiakkan tidak seperti enzim murni yang harganya relatif mahal.

TINJAUAN PUSTAKA

1.    Chlorella vulgaris

Mikroalga adalah organisme uniselular yang dapat berfotosintesis menggunakan sedikit energy dan karbon dioksida, dan memiliki efisiensi fotosintesis yang cukup tinggi (Miao et al. dalam Al-Iwayzy, 2014). Chlorella vulgaris termasuk dalam kelompok alga hijau (Chlorophyta) yang berbentuk bola kecil dan berwarna hijau, sehingga biasa disebut “the green ball” atau bola hijau.Alga ini pertama kali diperkenalkan dan diisolasi oleh Prof. M.W. Beijerinck pada tahun 1889 di Delft (Netherlands) (Ullmann, 2006). Chlorella vulgaris merupakan salah satu jenis alga yang berkemampuan tumbuh cepat dan mudah untuk ditumbuhkan.Namun, keberadaanya belum banyak dikomersialisasikan dikarenakan kandungan lipida yang rendah (Liu et al. dalam Al-Iwayzy, 2014).

Penelitian lain telah menyebutkan bahwa Chlorella vulgaris dapat bertahan pada lingkungan yang ekstrim serta banyak mengandung polusi terutama logam berat. Hal ini dikarenakan Chlorella vulgaris memiliki struktur yang relatif keras dan mempunyai sistem perbaikan DNA yang cepat dan pertahanan diri yang kuat terhadap kerusakan oksidatif yang tidak hanya disebabkan oleh bakteri atau virus, namun juga oleh logam berat (Liebke, 2015).

Pada penelitian yang diakukan oleh Greene (1985), Chlorella vulgaris diketahui sangat efektif dalam meremediasi sampel air yang mengandung uranium (UO₂²⁺), Pb²⁺, Al³⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Cr³⁺, Cu²⁺, dan Ni²⁺. Mekanisme penghilangan ion logam secara biologis pada suatu larutan oleh Chlorella vulgaris dibagi atas tiga tahap, yang pertama adsorpsi logam berat ke dinding sel, kemudian logam tersebut di-uptakesecara intraseluler dan yang terakhir adalah perubahan kimia dari ion logam (Greene, 1985).

2.    Enzim alkalin fosfatase dan cholinesterase

Alkalin fosfatase merupakan suatu enzim hidrolase yang dapat memutus gugus fosfat dari beberapa molekul, antara lain nukleotida, protein dan alkaloid. Proses dari pemutusan terebut adalah defosforilasi. Enzim ini bekerja paling baik pada pH lingkungan yang basa (Tamas, 2002). Menurut Ross et al. (1951), enzim alkalin fosfatase memiliki aktivitas optimum pada pH sebesar 9,13 dalam 10 mg/ml glycerophosphate sebagai substrat. Namun nilai pH tersebut dapat meningkat maupun menurun tergantung dari konsentrasi dan jenis substrat yang digunakan.

Dalam biokimia, enzim cholinesterase merupakan salah satu enzim yang berperan dalam mengkatalisis proses hidrolisis dari acetylcholine menjadi choline dan asam asetat pada neurotransmitter. Enzim cholinesterase mempunyai aktivitas optimum pada suhu berkisar antara 8,0 hingga 9,0 (Chadwick et al., 1954). Secara umum, aktivitas enzim cholinesterase akan terhambat oleh senyawa phosphorous yang akan berikatan langsung pada situs aktif enzim.

3.    Karakteristik logam berat, organofosfat dan karbamat

Logam berat yang paling sering dijumpai sebagai pencemar pada ekosistem perairan adalah arsenic, cadmium, chromium, copper, nikel, timbal dan merkuri. Saat pH perairan menurun, maka solubilitas logam berat akan meningkat yang menyebabkan partikel logam tersebut dapat lebih mudah bergerak. Logam-logam berat tersebut menjadi polutan pada perairan dikarenakan termasuk senyawa non-biodegradable, yaitu senyawa yang tidak bisa dipecah lagi menjadi senyawa lain yang lebih sedikit berbahaya bagi lingkungan. Secara umum, bentuk ion dari logam berat adalah bentuk yang lebih berbahaya, karena ia dapat membentuk senyawa toksik lain. Reaksi yang melibatkan transfer electron dan terhubung dengan oksigen, akan membentuk senyawa toksik oksiradikal seperti anion superoxide (O₂^-) dan hidroksi radikal (OH^-) yang akan menyebabkan kerusakan jaringan sel yang serius (Lenntech, 1998).

Untuk perlindungan terhadap kesehatan manusia, Environmental Protection Agency memberikan rekomendasi tentang konsentrasi maksimum logam berat pada perairan sebagaimana dapat dilihat pada tabel berikut:

Tabel 1. konsentrasi maksimum logam berat pada perairan

Metal	Chemical Symbol	Konsentrasi maksimum (mg/m3)
Mercury	Hg	0,144
Lead	Pb	5
Cadmium	Cd	10
Selenium	Se	10
Thallium	Tl	13
Nickel	Ni	13,4
Silver	Ag	50
Manganese	Mn	50
Chromium	Cr	50
Iron	Fe	300
Barium	Ba	1000

Sumber: EPA (1987)

4.    Biosensor konduktometrik

Biosensor konduktometrik digunakan dengan cara memonitor laju reaksi dari suatu larutan sehingga didapatkan nilai konduktansi. Teknik ini melibatkan pengukuran perubahan konduktansi yang disebabkan oleh migrasi ion. Beberapa reaksi yang melibatkan enzim akanmenghasilkan perubahan konsentrasi total ion yang dapat diukur. Hal tersebutlah yang mendasari metode biosensor konduktometrik (Wilson, 2005).

FABRIKASI BIOSENSOR

Bahan yang digunakan yaitu Chlorella vulgaris strain (CCAP211/12) yang mengandung enzim akalin fosfatase dan acetylcholinesterase, Bovine seum albumin (BSA), 25% larutan aqueous glutaraldehid (GA), substrat berupa Paranitrophenyl phosphate (pNPP) dan Methyl-umbelli-feryl-phosphate (MUP), Fluorescein diacetate (FDA), Acetylcholine chloride (AchCl), dan Butyrycholine chloride (BChCl). Sedangkan material untuk pembuatan biosensor bi-enzimatik ini terdiri dan terbuat dari transduser konduktometrik, dua pasang logam platinum (Pt), logam timah (Ti), Si­­­₃N₄, elektroda, dan pyrex glass.

Sensor dibuat dengan menginterdigitasi 2 buah elektroda Pt yang memiliki ketebalan 150 nm pada substrat gelas pirex menggunakan proses lift off. Untuk meningkatkan tingkat adhesi dari Pt terhadap substrat, maka digunakan Ti intermediate dengan ketebalan 50 nm.Bagian tengah sensor dipasifkan dengan menambahkan lapisan Si₃N₄ untuk menunjukkan bagian sensor yang menjadi “situs aktif”. Sensor didesain dengan lebar digit dan jarak interdigital sebesar 10 µm dan panjang 1 mm, sehingga bagian sensitive pada masing-masing elektroda adalah sebesar 1 mm².

Pengukuran substrat dilakukan berdasarkan deteksi keberagaman konduktivitas dari larutan yang ada di dalam membran BSA yang mengandung mikroalga. Alkaline phosphatase dan chlorinesterase, layaknya enzim lain, juga akan meng-induce reaksi katalis dengan menkonsumsi atau memproduksi ionic species yang berbeda yang akan menghasilkan perubahan konduktivitas yang dapat diukur.

HASIL

a.    Pengukuran Residu Logam Berat

Ion logam berat yang diuji ada tiga, yaitu Cd²⁺, Zn²⁺, dan Pb²⁺. Enzim yang bertanggung jawab menguji adanya ion logam adalah enzim alkalin fosfatase. Kecepatan aktivitas residual alkalin fosfatase (APA_res) untuk dua konsentrasi substrat pNPP setelah dipaparkan ion logam Cd²⁺ dan Zn²⁺ (1 ppb sampai 1 ppm). Kedua ion logam tersebut memberikan penghambatan yang signifikan pada enzim pada konsentrasi 1 ppm dan 100 ppb setelah dipaparkan selama 30 menit.

Untuk ion logam Cd²⁺, APA_res kurang dari 85% untuk 100 ppb dan kurang dari 50% untuk 1 ppm. Ion logam Zn²⁺, APA_res kurang dari 75% untuk 100 pb dan kurang dari 70% untuk 1 ppm. Sehingga dari sini, Cd²⁺ sama halnya dengan Zn²⁺, konsentrasi 10 ppb dapat dikatakan sebagai konsentrasi batas/limit deteksi. Pemaparan yang dilakukan selama 60 menit pada konsentrasi 10 ppb telah dilakukan terhadap Cd²⁺ dan Zn²⁺_, tetapi tidak terjadi penghambatan yang signifikan. Sedangkan Ion logam Pb²⁺ juga diketahui sebagai penghambat aktivitas enzim alkalin fosfatase (APA) (Durrieu et al., 2003). Namun dengan biosensor konduktometrik tidak terjadi penghambatan yang terdeteksi walaupun diberikan konsentrasi ion logam Pb^{2+ ­}yang tinggi (1 ppm dan 100 ppb).

Untuk mengetahui apakah terjadi efek sinergis dan antagonis dari kedua ion logam Cd²⁺ dan Zn²⁺, dilakukan pencampuran larutan yang mengandung kedua ion logam tersebut dengan cara biosensor dipaparkan selama 30 menit (hasil lihat gambar 6). Konsentrasi campuran ion logam yang diuji  adalah 1 ppm Cd²⁺/1 ppm Zn²⁺ dan 100 ppb Cd²⁺/100 ppb Zn²⁺. Untuk campuran dengan konsentrasi 100 ppb, APA_res berkurang 85% dan berkurang 40% untuk konsentrasi 1 ppm. Sehingga konsentrasi 10 ppb diperkirakan sebagai limit deteksinya. Karena sulit membandingkan APA_res dihitung dengan biosensor yang berbeda, bioassay menggunakan C.vulgaris bebas (tidak diketahui strainnya) dipaparkan ke Cd²⁺/Zn²⁺ selama 240 menit yang hasilnya dapat diketahui pada gambar 7. Namun dengan kedua cara yang berbeda tersebut tidak memungkinkan untuk menentukan efek antagonis atau sinergisnya.

Berdasarkan berbagai hasil pengujian yang didapatkan diatas dapat diambil bebarapa kesimpulan. Pertama, membandingkan perhitungan APA_res untuk biosensor dan bioassay telah menunjukkan bahwa biosensor mempunyai sensitivitas lebih tinggi dibandingkan bioassay. Pemaparan dengan waktu yang lebih singkat, APA_res lebih tinggi untuk biosensor. Sebagai contoh APA_res adalah 50% setelah 30 menit pemaparan terhadap 1 ppm Cd²⁺ dengan biosensor, namun bioassay membutuhkan waktu 240 menit untuk mencapai tingkat penghambatan yang sama. Penjelasan mengenai sensitivitas biosensor yang lebih tinggi ini karena pada biosensor digunakan jumlah organisme target lebih sedikit yang dipaparkan ke senyawa toksik dibandingkan bioassay. Bioavailibilitas ion logam juga merupakan faktor penting, karena pada bioassay, Pb²⁺ sangat menghambat APA (lihat gambar. 7), tetapi pada biosensor tidak terjadi penghambatan.

b.    Pestisida

Pestisida yang diuji pada artikel ini adalah karbamat jenis carbofuran (CF)  dan organofosfat jenis parathion-methyl (MP) , keduanya diketahui sebagai penghambat enzim acetylcholinesterase (AChE). Biosensor alga konduktometrik diikubasi atau dipaparkan ke CF dan MP selama 30 menit. Namun, mereka tidak menunjukkan penurunan sinyal. Tidak adanya hambatan AChE C.vulgaris terhadap CF dan MP ini juga tejadi pada bioassay. Padahal pada penelitian yang dilakukan oleh beberapa peneliti sebelumnya menunjukkan bahwa dua pestisida tersebut mempunyai pengaruh terhadap enzim AChE murni yang imobilisasi ke biosensor dan penghambatan terjadi secara signifikan oleh CF. Sedangkan untuk pestisida MP, studi yang sudah dilakukan lebih sedikit. Hal ini dimungkinkan karena tingkat toksisitas yang rendah terhadap enzim AChE murni. Namun diketahui bahwa oraganofosfor mudah terdegradasi menjadi produk yang berbeda, salah satunya MP yang mempunyai penghambatan yang tinggi terhadap enzim AChE.

Dalam pengujian pestisida, organofosfat diuji menggunakan enzim AChE yang terdapat pada mikroalga C.vulgaris. biosensor diinkubasi selama 30 menit dalam 1 ppm dan 100 ppb AChCl, penghambatan akan terjadi pada kedua konsentrasi tersebut (lihat gambar. 8). Pada 100 ppb, kecepatan aktivitas residual AChE (AChE_res) adalah 80% untuk 4mM AChCl dan untuk 1 ppm, AChE_res lebih kecil dari 85% untuk kedua konsentrasi AChCl. Hasil bioassay juga menunjukkan adanya penghambatan untuk jenis enzim esterase dari C.vulgaris yang ditunjukkan pada gambar. 9 (AChE_res adalah 70% untuk 100 ppb dan 50% untuk 1 ppm).

Hasil tersebut membuktikan sensitivitas C.vulgaris terhadap pestisida karbamat dan organofosfat. Sedangkan untuk sensitivitas enzim AChE murni terhadap pestisida lebih rendah. Dapat disimpulkan bahawa respon dan sensitivitas dari biosensor tegantung pada asal enzim yang dipakai.

c.    Campuran Cd²⁺/MP

Percobaan pertama dilakukan dengan pemaparan biosensor selama 30 menit terhadap campuran yang mengandung 25 ppb Cd²⁺/50 ppb MPx (lihat gbr.10). APA_res dan AChE_res yang didapatkan dengan dua biosensor dibandingkan dengan yang didapatkan setelah dipaparkan ke larutan Cd²⁺ dan MPx (lihat gbr. $ dan 9). Untuk APA, 25 ppb Cd²⁺ tidak memberikan sinyal penurunan APA. Untuk AChE diukur dengan biosensor yang sama, ternyata terjadi penghambatan (AChE_{res ­­}adalah  80% dan 65% tergantung biosensor). Selanjutnya efek sinergis dan antagonis dari campuran ini dapat diamati pada aktivitas enzim keduanya (gbr. 10).

Dengan hasil dari percobaaan pertama yang menggunakan campuran sebagai larutan yang diuji membuktikan bahwa biosensor bi-enzimatik ini dapat menjadi pertimbangan yang baik untuk membedakan senyawa toksik pada larutan yang tidak diketahui kandungannya berdasarkan aktivitas enzim mana yang terhambat.

PERBANDINGAN BIOSENSOR BI-ENZIMATIK DENGAN METODE LAIN

a.    Perbandingan dengan metode konvensional dalam pengujian residu logam berat dan pestisida

Pengujian residu ion logam dan pestisida menggunakan biosensor bi-enzimatik dapat mendeteksi residu ion logam berat dan pestisida secara bersamaan. Namun cara atau metode konvensional tidak bisa dilakukan secara bersamaan. Pengujian seluruh jenis ion logam berat juga tidak bisa dilakukan secara bersamaan karena perbedaan karakteristik yang dimiliki.  Metode pengujian adanya residu ion logam berat, metode konvensional yang biasanya digunakan adalah Neutron Activation Analysis (NAA) yang digunakan untuk mendeteksi ion logam Zn²⁺, Hg²⁺ dan Cd²⁺, sedangkan metode Atomic Absorption Spectrophotometry (AAS) digunakan untuk mendeteksi ion Pb²⁺ (Arifin dkk., 2005).

Pengujian adanya residu pestisida jenis karbamat dan organofosfat secara konvensioanal dilakukan dengan menggunakan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), dan Karl Fisher Titrator. Namun metode yang sering digunakan dalam pengujian kadar resdiu pestisida adalah kromatografi gas (Kristianingrum, 2009).

Metode menggunakan biosensor konduktometrik bi-enzimatik dengan metode konvensional memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Berikut tabel yang menyajikan hal tersebut.

Metode	Kelebihan	Kekurangan
Biosensor bi-enzimatik	· Dapat mendeteksi residu ion logam dan pestisida sekaligus · Biaya relatif lebih murah · Perangkat berukuran lebih kecil · Proses analisa lebih sederhana · Hasil analisa cepat diketahui	· Keakuratan tergantung sensitivitas enzim · Tidak semua jenis ion logam berat yang dapat terdeteksi · Penyimpanan alat membutuhkan kosndisi lingkungan yang sesuai karena menggunakan komponen makhluk hidup
Konvensional	· Ketelitiannya lebih tinggi · Jenis senyawa toksik yang bisa terdeteksi lebih kompleks	· Biaya relatif mahal · Proses analisa rumit · Membutuhkan waktu lama untuk mengetahui hasil analisa · Membutuhkan banyak komponen alat · Perangkat alat berukuran besar · Jumlah alat yang digunakan lebih kompleks · Banyak perlakuan pendahuluan terhadap sampel · Membutuhkan sampel standar sebagai pembanding pengujian

b.    Perbandingan dengan metode sebelumnya untuk analisa residu ion logam berat dan pestisida

Metode pengujian residu polutan seperti ion logam berat dan pestisida dengan biosensor sebelumnya dilakukan secara terpisah. Karena setiap polutan hanya bisa dideteksi dengan enzim tertentu saja jika menggunakan biosensor berbasis enzim. Salah satu biosensor yang digunakan untuk mengecek ion logam berat adalah biosensor dengan enzim urease yang diimobilisasi. Selain itu biosensor yang sering digunakan untuk menguji adanya residu logam berat adalah biosensor yang menggunakan enzim oksidase dan dehidrogenase yang diimobilisasi. Biosensor ini digunakan untuk deteksi garam merkuri, seng, perak, kadmium, dan tembaga berdasarkan jumlah inaktivasi enzim. Enzim yang digunakan diimobilisasi dengan ikatan kovalen dengan glutaraldehid ke sebuah membran dan dipasangi dengan elektroda oksigen Clark. Ketika diinkubasi dengan substratnya, akan terjadi penurunan jumlah oksigen. Logam berat akan menghambat enzim sehingga akan terjadi pengurangan konsumsi oksigen. Karena penghambatan ini, enzim akan mengalami penurunan aktivitas (inaktivasi) dimana penurunan aktivitas ini akan dikonversi sebagai sinyal adanya residu logam berta dalam analit (Dennison dan Turner, 1995).

Pengujian pestisida mnggunakan biosensor juga dilakukan dengan menggunakan satu jenis enzim yang spesifik. Salah satu contoh pengujian pestisida menggunakan biosensor adalah biosensor yang berbasis enzim organophosphorus acid anhydrolase (OPAA) untuk menguji kandungan pestisida organofosfat. Prinsip kerja biosensor ini adalah enzim tersebut akan secara selektif menghidrolisis ikatan P-F dari fluorin yang mengandung senyawa organofosfat seperti diisopropil fluorofosfat (DFP). Enzim OPAA  diimobilisasi ke silica gel menggunakan ikatan kovalen. Pengukurannya dilakukan secara batch melalui elektroda pH dari kaca yang berpermukaan datar. Elektroda ini akan mendeteksi adanya perubahan pH seiring lepasnya ikatan P-F akibat pestisida bereaksi dengan enzim. Di perangkat biosensor ini dilengkapi elektroda pH lain sebagai standar, sehingga perubahan pH akan diukur sebagai konsentrasi residu pestisida yang dideteksi (Simonian et al., 2001).

Sehingga dari sini bisa ditarik kesimpulan bahwa perbedaan biosensor bi-enzimatik dengan biosensor sebelumnya adalah biosensor bi-enzimatik ini menggunakan organisme hidup berupa mikroalga C.vulgaris yang mempunyai dua enzim yang bisa mendeteksi keberadaaan residu ion logam berat dan pestisida secara bersamaan. Sedangkan biosensor yang ada sebelumnya hanya menggunakan satu enzim murni bukan dari oragnisme hidup yang sensitif terhadap salah satu dari pestisida atau logam berat. Persamaannya yaitu prisnsipnya sama-sama menggunakan penghambatan kinerja enzim sebagai tanda adanya resid polutan.

DAFTAR PUSTAKA

Arifin M, Subagio B.E, Rianto E., Purbowati E., Purnomoadi A., dan Dwiloka B. 2005. Residu Logam Berat pada Sapi Potong yang dipelihara di TPA Jatibarang, Kota Semarang Pascaproses Eliminasi selama 90 Hari. Semarang: Universitas Diponegoro.

Al-Iwayzy, S, H et al., 2014.Biofuels from the Fresh Water Microalgae Chlorella vulgaris (FWM-CV) for Diesel Engines. Energies.ISSN 1996-1073.

Aziz, Thamrin. 2012. Desain dan Karakterisasi Biosensor Berbasis Imobilisasi Enzim untuk Analisis Residu Pestisida Dianzinon dalam Tanaman Kubis (Brassica oleracea). Kendari: Universitas Haluoleo.

Chadwick, L. E., Lovell, J. B., Egner, V. E. 1954. The Relationship Between pH and the Activity of Cholinesterase from Flies.The Biological Bulletin. Vol. 106, No 2

Chouteau, Celine; Dzyadevych, Sergei; Durrieu, Claude; dan Chovelon, Jean-Marc. 2005. A Bi-enzymatic Whole Cell Conductrimetric Biosensor for Heavy Metal Ions and Pesticides Detection in Water Samples. Ukraine: Institute of Molecular Biology and Genetics.

Dennison M.J., dan Turner A.P.F. 1995. Biosensor for Environmental Monitoring. Cranfield: Cranfield University 0734-9750(94)000240-4.

Greene, B. 1985.Removal of Heavy Metal Ions from Contaminated Water by Chlorella vulgaris.Chemistry Departement, New Mexico State University.

Kristianingrum, Susila. 2009. Kajian Berbagai Metode Analisis Residu Pestisida dalam Bahan Pangan. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.

Liebke, F. 2015. Chlorella vulgaris – Medicinal Food.http://www.klinghardtacademy.com/ Diakses tanggal 29 Maret 2015 pukul 22.40.

Ross, M. H., Ely, J. O., Archer, J. G. 1951.  Alkaline Phosphatase Activity and pH Optima.The Jounal of Biological Chemistry.192:561-568

Simonian Al., Grimsley J.K., Flounders A.W., Schoeniger J.S., Tu-Chen Cheng, DeFrank J.J., Wild J.R. 2001. Enzyme-based biosensor for the direct detection of fluorine-containing organophosphates. Analytica Chimica Acta 442 (2001) 15-23.

Tamás L, Huttová J, Mistrk I, Kogan G. 2002. Effect of Carboxymethyl Chitin-Glucan on the Activity of Some Hydrolytic Enzymes in Maize Plants. Chem. Pap. 56 (5): 326–329

Ullmann, J. 2006. The Difference Between Chlorella vulgaris and Chlorella pyrenoidosa. Algomed Publication.

United States Environmental Protection Agency. 2012. An Introduction to Water Quality Monitoring. http://water.epa.gov/ diakses pada tanggal 11 April 2015 pukul 20.21.

Wilson, J. 2005. Sensor Technology Handbook. Oxford. Newnes.

World Health Organization. 1997. Water Pollution Control: A Guide to the Use of Water Quality Management Principles. London:E&FN Spon